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Western Blot實(shí)驗(yàn)過程中常遇到的問題

Western 免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。

WB 實(shí)驗(yàn)中常會(huì)出現(xiàn)各種問題，迪申生物技術(shù)（上海）有限公司專注于生物試劑免疫組化相關(guān)產(chǎn)品多年，對(duì) WB 實(shí)驗(yàn)有一定了解，今天跟各位同學(xué)一起分享下 WB 實(shí)驗(yàn)中各種問題及應(yīng)用對(duì)策。

電泳條帶成笑臉狀 膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統(tǒng)溫度偏高 減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳

電泳條帶成皺眉狀 可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不* 調(diào)整裝置

拖尾 樣品溶解不好 樣品充分溶解混勻后上樣

紋理(縱向條紋) 樣品中含有不溶性顆粒 樣品充分?jǐn)嚢杌靹?/p>

條帶偏斜 電極不平衡或者加樣位置偏斜 調(diào)整電極和加樣

條帶兩邊擴(kuò)散 加樣量過多 適當(dāng)減少上樣量

Marker 變黑色 抗體和 Marker 蛋白反應(yīng) 在 Marker 和 sample 之間空出一個(gè)孔不上樣

背景高 膜封閉不夠 延長封閉時(shí)間，選擇適宜的抗體稀釋度

一抗稀釋度不適宜 對(duì)抗體進(jìn)行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度

一抗孵育的溫度偏高 建議 4℃ 結(jié)合過夜

二抗?jié)舛榷冗^高 降低二抗?jié)舛?/p>

二抗的非特異性背景 增加一個(gè)二抗對(duì)照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否是由于二抗所致?？蛇x擇其它二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對(duì)重鏈）

二抗孵育時(shí)間過久 減少二抗孵育時(shí)間

選擇膜的問題 硝酸纖維素的背景會(huì)比 PVDF 膜低

膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過 實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持膜的濕潤

檢測時(shí)曝光時(shí)間過長 注意曝光時(shí)間的縮短

洗膜不充分 增加洗膜的時(shí)間和次數(shù)

抗體和封閉蛋白有交叉反應(yīng) 檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應(yīng)

雜帶較多 目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（化位點(diǎn)，糖基化位點(diǎn)，乙?；稽c(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶 查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白試劑大小

目的蛋白有其他剪切本 查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性

樣品處理過程中目的蛋白發(fā)生降解 裂解液中加入蛋白酶抑制劑，樣品處理在冰上進(jìn)行

上樣量過高，太敏感 適當(dāng)減少上樣量

一抗不純 純化抗體

一抗特異性不高 重新選擇或制備高特異性的抗體

二抗的非特異性結(jié)合 增加一個(gè)二抗對(duì)照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否是由于二抗所致?？蛇x擇其它二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對(duì)重鏈）

一抗或二抗?jié)舛绕?降低抗體濃度

細(xì)胞傳代較多，導(dǎo)致蛋白變異 使用原代或傳代少的細(xì)胞作對(duì)照

蛋白條帶位置

（大?。┎粚?duì) 二聚體或多聚體存在 增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度

翻譯后剪切 比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執(zhí)行功能時(shí)需要進(jìn)行剪切成活化的形式

相對(duì)電荷 氨基酸電荷的組成

蛋白修飾 比如糖基化、化等修飾狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致蛋白分子量增加

膠濃度 不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差

無蛋白條帶 抗體孵育不充分 增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間

酶失活 直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 設(shè)置陽性對(duì)照，如果陽性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低?？煽紤]增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因