組織甘油三酯檢測(cè)試劑盒操作方法詳解！
描述：
甘油三酯是由甘油和脂肪酸酯化而成，是血脂的主要成分，也是機(jī)體重要的供能物質(zhì)。高甘油三酯和高膽固醇血癥是常見(jiàn)的高脂血癥，與許多疾病相關(guān)。與血漿甘油三酯測(cè)定相比，實(shí)體組織和細(xì)胞的甘油三酯測(cè)定并非易事。本試劑盒避免了有毒的lv仿甲醇提取、繁雜的氮?dú)獯蹈珊椭|(zhì)復(fù)溶等步驟，采用能試劑進(jìn)行組織細(xì)胞裂解和甘油三酯抽提，而且優(yōu)化了GPO Trinder酶學(xué)反應(yīng)組分和操作步驟。簡(jiǎn)單易行、靈敏度高檢測(cè)范圍為 20-2000µmol/L?？捎糜跍y(cè)量動(dòng)植物組織細(xì)胞、固態(tài)食品材料、高濃度油料樣品中的甘油三酯含量。
原理：
（1）脂肪酶分解血清中的甘油三酯為甘油；（2）甘油激酶將甘油化為3-甘油；（3）3-甘油被甘油氧化酶氧化產(chǎn)生*；在過(guò)氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。
適用范圍：適用于動(dòng)物實(shí)體組織、培養(yǎng)細(xì)胞、油料植物組織、固態(tài)食品組織、高濃度油料樣品中甘油三酯含量的測(cè)定。
操作方法：
組織細(xì)胞裂解：
在裂解前，組織或者細(xì)胞用PBS洗滌兩次以去除甘油
1. 原代脂肪細(xì)胞：200g，5分鐘離心收集細(xì)胞。建議每100 µl壓積（Packed Cell Volume）脂肪細(xì)胞加入1ml裂解液，震蕩裂解，而后室溫靜置10分鐘。
2. 分化脂肪細(xì)胞或非脂肪細(xì)胞：可先用胰酶消化、離心收集細(xì)胞而后進(jìn)行裂解，也可直接在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行裂解。通常情況下，可按比例每1x106 個(gè)細(xì)胞加入0.1ml裂解液，混勻后室溫靜置10分鐘。
3. 動(dòng)物組織：離心管稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計(jì)算組織重量(約50mg)。強(qiáng)烈建議按比例每1mg組織加20µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。強(qiáng)烈建議裂解液用量在1ml左右，保證有效的勻漿裂解與脂質(zhì)提取。用電動(dòng)高速勻漿器或手動(dòng)玻璃勻漿器破碎組織。（不推薦超聲方法，因其不能*和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的組織細(xì)胞加入量），勻漿后靜置10分鐘。
4. 植物油料種子、食品、含高油量樣品：用減量稱重法對(duì)樣品進(jìn)行稱重，建議按比例每1mg組織加20µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。加入裂解液后可用研缽對(duì)樣品進(jìn)行研磨，而后將研磨液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，室溫靜置10分鐘。
組織甘油三酯檢測(cè)試劑盒操作方法詳解！
二. 裂解液處理：
1. 取適量上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，進(jìn)行步驟2的操作。余下的裂解液可用BCA法蛋白定量試劑盒(#P1511)進(jìn)行蛋白定量或－20ºC儲(chǔ)存。
2. 70ºC 加熱10分鐘，組織量多時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀。
3. 室溫2000rpm離心5分鐘，上層清液即可用于酶學(xué)測(cè)定。
二 工作溶液配制：按4:1比例，取4ml試劑R1與1ml試劑R2混合即可，立即使用或4ºC保存<1天，變色棄去。
三 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，將4mM甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常取其中4~6管即可，注意設(shè)置0濃度對(duì)照反應(yīng)管。
注意事項(xiàng)：
1. 維生素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、強(qiáng)還原劑二硫蘇糖醇、巰基乙醇等會(huì)干擾測(cè)。高濃度EDTA會(huì)干擾測(cè)定。
2. 樣本即使保存在-20ºC的環(huán)境下，甘油三酯也會(huì)自發(fā)水解。因此建議樣品4ºC保存時(shí)間應(yīng)短于24小時(shí)，當(dāng)-70ºC保存時(shí)，也應(yīng)不超過(guò)1個(gè)月。
3. 如果室溫較低，應(yīng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或在37ºC進(jìn)行反應(yīng)。
4. 不同類型組織和細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量差別很大，應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的裂解液的加入量。對(duì)于脂肪組織而言，一般來(lái)說(shuō)裂解液用量在20-30mg/ml即可。
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